Tinción H&E en microscopía -

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Cómo hacer que las estructuras sean visibles en muestras de patología y por qué los microscopios juegan más de un papel

Si consideramos el papel de la microscopía en la rutina diaria de los patólogos, a menudo pensamos en el diagnóstico. Si bien los microscopios juegan un papel crucial en esta etapa del flujo de trabajo del laboratorio de patología, se usan incluso antes: los técnicos de laboratorio o los patólogos usan microscopios para verificar la tinción.

Sin tinción, la vista a través del microscopio revela algunos detalles estructurales básicos de las secciones de tejido o frotis, pero la mayoría de los detalles no son visibles. Esto es especialmente cierto con secciones muy delgadas que carecen de contraste y pueden parecer casi translúcidas.

Figura 1: estas imágenes muestran una sección de tejido sin teñir. Sin el uso de agentes de contraste como la hematoxilina y la eosina, es casi imposible identificar diferentes tipos de células o compartimentos de tejido, por lo que es difícil extraer mucha información útil de las imágenes o incluso llegar a un diagnóstico.

La tinción agrega contraste a medida que los diferentes componentes de la muestra adquieren un color y una intensidad de tinción diferentes, lo que hace visibles las estructuras dentro del tejido. La combinación de tinción de elección más común es hematoxilina y eosina, tinción H&E para abreviar.

Figura 2: Los portaobjetos de vidrio se sumergen en diferentes soluciones para la tinción.

El principio de la tinción H&E

La tinción con H&E se aplica después de que el tejido se haya fijado, deshidratado, incrustado, seccionado y la sección se haya montado en un portaobjetos de vidrio. Antes de teñir, el medio de inclusión, normalmente cera de parafina, debe eliminarse con disolventes, normalmente xileno. A continuación, la sección se rehidrata pasándola por soluciones alcohólicas graduadas de concentración decreciente y terminando con agua.

En el siguiente paso, la sección se sumerge en una solución de hematoxilina para teñir los núcleos celulares. La intensidad de la mancha depende del tipo de tejido, el grosor de la sección, la duración de la inmersión, por nombrar solo algunos factores. Las preferencias de los patólogos que miran las láminas también juegan un papel. Después de un enjuague con agua, el azulado cambia la mancha rojiza de la hematoxilina a azul.

Figura 3: Esta imagen muestra núcleos en el duodeno de cerca, con un aumento de 40x. Se tiñen de azul con hematoxilina. A pesar de la densa densidad de células en el tejido, la sutil tinción rosada de la eosina revela los pliegues y otras estructuras dentro del tejido.

Comprobación de la intensidad y la tinción de fondo

Una revisión rápida con el microscopio les dirá a los técnicos de laboratorio o patólogos si la mancha es suficiente o demasiado fuerte. Si la tinción es insuficiente, repetirán la inmersión en Hematoxilina. Si la mancha es demasiado intensa y la sección muestra tinción de fondo, diferenciarán la sección para reducir la tinción con la ayuda de una solución ácida. Después de este paso, es necesario volver a teñir y enjuagar con agua del grifo.

El siguiente paso es la tinción de eosina. La eosina es una contratinción de la hematoxilina que permite la diferenciación de glóbulos rojos, colágeno y músculo liso con diferentes tonos de rosa. También puede ser necesaria la diferenciación para eliminar el exceso de eosina, lo que se puede lograr con agua. Luego, los portaobjetos teñidos se deshidratan sumergiéndolos en alcoholes graduados y luego en xileno. Una vez completada la tinción y la deshidratación, las secciones se montan utilizando una gota de medio de montaje y un cubreobjetos.

Cuándo comprobar la tinción

Los protocolos difieren en cuanto a si es necesario comprobar la tinción y la diferenciación bajo el microscopio después de la tinción con hematoxilina o después de la tinción con eosina. La verificación después de la tinción con hematoxilina tiene la ventaja de poder ajustar inmediatamente, ya sea para volver a sumergir o repetir la diferenciación. La verificación después de la tinción con eosina brinda a los técnicos de laboratorio o patólogos una mejor idea del portaobjetos completamente teñido.

Si bien ambas son posibles, la verificación rápida juega un papel importante en el flujo de trabajo del laboratorio, ya que garantiza que los patólogos que realizan el diagnóstico puedan ver los detalles que necesitan.

Estructuras visibles

Los portaobjetos teñidos con H&E se observan utilizando iluminación de campo claro. Mientras que la hematoxilina tiñe los núcleos de un color púrpura azulado, la eosina tiñe el citoplasma celular y el tejido conectivo de color rosado. Los patólogos pueden diferenciar fácilmente entre varios tipos de tejido, como músculo o tejido conectivo, y percibir anomalías o irregularidades en las secciones debido a la tinción. Esto les ayuda a identificar cambios que podrían ser responsables de patologías específicas, como una infección, una inflamación crónica o un tumor maligno. La información visual permite a los patólogos observar cambios estructurales dentro de los tejidos, lo que les permite determinar la naturaleza y el progreso de las enfermedades.

Figura 4: esta imagen general con un aumento de 5x muestra tres capas distintas de tejido en el duodeno: las regiones serosa, submucosa y mucosa. Cada región reacciona de manera diferente con la hematoxilina y la eosina, por lo que los colorantes facilitan la distinción de las capas límite. Para identificar la condición médica subyacente, es clave definir exactamente en qué parte del tejido y en qué tipo de células ocurre una patología.

Figura 5: Este aumento de 40x de un duodeno muestra el límite entre las regiones submucosa y mucosa. La tinción H&E facilita la distinción entre los tipos de células. Un tipo de célula que atraviesa la barrera natural entre los dos compartimentos de tejido es un indicador común de la progresión del cáncer.

Diferenciación de colores

Los microscopios utilizados en el flujo de trabajo de tinción, así como para el diagnóstico, deben proporcionar una buena diferenciación de colores, ya que es crucial para diagnósticos oportunos y precisos. La verificación de la tinción generalmente se realiza con un microscopio independiente que ocupa poco espacio, ya que las mesas de laboratorio suelen ser espacios de trabajo abarrotados.

Los microscopios utilizados para diagnósticos deben estar equipados con una buena cámara para que se capturen las sutiles variaciones de color en las imágenes requeridas para el informe y el archivo. Las funcionalidades de anotación también son útiles para la creación de informes. Si está interesado en obtener más información sobre los microscopios clínicos adecuados, puede encontrar útil el artículo “Factores a considerar al seleccionar microscopios clínicos”.