![\"\"](\"https:\/\/i0.wp.com\/www.bairesac.com\/blog\/wp-content\/uploads\/2017\/11\/csm_Fluorescence_and_Quantum_Dots_cell_Series044_decon_converted_Processed001_64c4e051cd.jpg\")
<\/a>La unidad b\u00e1sica de longitud de onda es el medidor y la \u00ablongitud de onda\u00bb se define como la distancia entre dos picos o valles sucesivos de una onda de luz. El s\u00edmbolo para la longitud de onda es la letra griega lambda (l). Las longitudes de onda que se usan t\u00edpicamente en microscop\u00eda est\u00e1n en el rango nanom\u00e9trico (nm) dentro del espectro visible entre 400 y 700 nm, el espectro UV debajo de 400 nm y el espectro IR que comienza a 700 nm (Figura 2).<\/p>\n Los fluor\u00f3foros se clasifican por su longitud de onda de excitaci\u00f3n y emisi\u00f3n, que generalmente se presenta en forma de un gr\u00e1fico que muestra los picos m\u00e1ximos. Los fluor\u00f3foros son naturalmente estables en lo que se denomina el \u00abestado fundamental\u00bb. Cuando absorben un fot\u00f3n de luz (de la luz de \u00ablongitud de onda m\u00e1s corta\u00bb), la energ\u00eda del fot\u00f3n eleva los electrones del fluor\u00f3foro a un estado de \u00abexcitaci\u00f3n\u00bb de energ\u00eda superior. Los electrones excitados no permanecen en este estado, pero pierden la energ\u00eda vibratoria y emiten un fot\u00f3n de una longitud de onda m\u00e1s larga en su retorno al estado fundamental.<\/p>\n Para los fluor\u00f3foros usados \u200b\u200ben microscop\u00eda, un ciclo completo desde la excitaci\u00f3n hasta el retorno a tierra toma en la regi\u00f3n de 0.5 a 20 nanosegundos. Las longitudes de onda de excitaci\u00f3n y emisi\u00f3n de fluor\u00f3foros se abrevian com\u00fanmente como la letra griega lambda con un sub\u00edndice \u00abex\u00bb (excitaci\u00f3n) o \u00abem\u00bb (emisi\u00f3n; lex o lem).<\/p>\n Cada fluor\u00f3foro tiene un espectro de excitaci\u00f3n y emisi\u00f3n m\u00e1ximo distinto y esta propiedad se usa para distinguir diferentes objetivos en el mismo esp\u00e9cimen de inter\u00e9s. Por ejemplo, usando la tinci\u00f3n fluorescente DAPI (4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindole) para resaltar las prote\u00ednas nucleares en una c\u00e9lula junto con la faloidina marcada fluorescentemente para resaltar el citoesqueleto de actina.<\/p>\n El diagrama de Jablonski de fluorescencia <\/strong><\/p>\n El f\u00edsico polaco Profesor Aleksander Jablonski (1898-1980) fue el primero en describir el ciclo entre el suelo \/ excitaci\u00f3n \/ emisi\u00f3n en un diagrama de energ\u00eda de tres niveles que se conoce simplemente como un \u00abDiagrama de Jablonski\u00bb. En 1930, recibi\u00f3 su doctorado de la Universidad de Varsovia por su tesis titulada \u00abSobre la influencia del cambio de la longitud de onda de la luz de excitaci\u00f3n en los espectros de fluorescencia\u00bb. Fue en 1933 que public\u00f3 su art\u00edculo (\u00abEficiencia de la fluorescencia anti-stokes en tintes\u00bb) en Nature que conten\u00eda el diagrama de Jablonski. Esta simple pero efectiva ilustraci\u00f3n del comportamiento de los fluor\u00f3foros resalta la excitaci\u00f3n desde el estado fundamental al estado excitado y de regreso al suelo con la emisi\u00f3n de un fot\u00f3n de longitud de onda m\u00e1s larga (Figura 3).<\/p>\n Aunque la Figura 3 es un diagrama de Jablonski simplificado, se debe tener en cuenta que los fluor\u00f3foros pueden existir en muchos estados diferentes de excitaci\u00f3n y emisi\u00f3n. Adem\u00e1s, los fluor\u00f3foros pueden volver a la tierra a trav\u00e9s de estados variables de relajaci\u00f3n conocidos como \u00abestados de triplete\u00bb, dependiendo de la rotaci\u00f3n electr\u00f3nica de las mol\u00e9culas.<\/p>\n El cambio de Stokes<\/strong><\/p>\n Sir George Gabriel Stokes (1819-1903) fue un matem\u00e1tico y f\u00edsico irland\u00e9s, y durante su vida realiz\u00f3 muchos descubrimientos y avances en el campo de la \u00f3ptica y la luz. Fue nombrado Catedr\u00e1tico Lucasiano de Matem\u00e1ticas en Pembroke College, Cambridge en 1849 y permaneci\u00f3 en este puesto hasta su muerte en 1903. Escribi\u00f3 un art\u00edculo maravillosamente descriptivo que se public\u00f3 en 1852 y se llam\u00f3<\/p>\n \u00abSobre el cambio de refrangibilidad de la luz\u00bb [1 ] El lenguaje utilizado en este texto es diferente al que estamos acostumbrados en la literatura cient\u00edfica moderna. Aqu\u00ed hay dos breves extractos del lenguaje maravilloso que Stokes us\u00f3; \u00abHacia el final del oto\u00f1o pasado, cuando la tardanza de la temporada ofrec\u00eda pocas oportunidades de observaci\u00f3n, aprend\u00ed de diferentes fuentes que el tipo de cristal amarillo que ya se ha mencionado como poseedor en un grado tan alto de la propiedad de la dispersi\u00f3n interna era coloreado con \u00f3xido de uranio \u00ab.<\/p>\n Y: \u00abFue ciertamente curioso ver el tubo iluminado instant\u00e1neamente cuando se sumergi\u00f3 en los rayos invisibles: era visible literalmente la oscuridad. En conjunto, el fen\u00f3meno ten\u00eda una apariencia sobrenatural\u00bb.<\/p>\n El \u00abcambio de Stokes\u00bb fue nombrado m\u00e1s tarde en su honor. Cuando los electrones excitados regresan al estado fundamental y emiten un fot\u00f3n de luz, la longitud de onda siempre es m\u00e1s larga que la que se utiliz\u00f3 para excitar el fluor\u00f3foro. Esto se debe a la propiedad de la luz por la cual la longitud de onda es inversamente proporcional a la energ\u00eda de la radiaci\u00f3n. El Stokes Shift describe la diferencia (en nan\u00f3metros) entre la excitaci\u00f3n del pico y la longitud de onda de emisi\u00f3n m\u00e1xima de un fluor\u00f3foro (Figura 4).<\/p>\n Distinguir entre la excitaci\u00f3n y la emisi\u00f3n de un fluor\u00f3foro es proporcionalmente m\u00e1s f\u00e1cil con un aumento en el cambio de Stokes. Los fluor\u00f3foros poseen caracter\u00edsticas \u00fanicas en t\u00e9rminos de su Stokes Shift, que se debe a su configuraci\u00f3n electr\u00f3nica y estructura molecular.\u00a0El descubrimiento y el uso de la prote\u00edna verde fluorescente\u00a0Fue Stokes quien utiliz\u00f3 por primera vez el t\u00e9rmino \u00abfluorescencia\u00bb para describir sus fen\u00f3menos observados, pero la historia se remonta a 1565. Un m\u00e9dico y bot\u00e1nico espa\u00f1ol llamado Nicolas Monardes describi\u00f3 un extra\u00f1o color azul de una infusi\u00f3n de madera de un \u00e1rbol mexicano, Lignum nephriticum. A pesar de estas primeras observaciones, unos 400 a\u00f1os m\u00e1s tarde aparecer\u00eda una sustancia verde fluorescente en un organismo vivo. En 1955 Davenport y Nicol publicaron un art\u00edculo [2] que describe el tejido fotog\u00e9nico en los eosin\u00f3filos de una subclase de medusas conocida como Hydromedusae. En ese momento, los autores de este trabajo no se dieron cuenta de que los eosin\u00f3filos conten\u00edan una prote\u00edna verde fluorescente (GFP).<\/p>\n No fue hasta 1962 que Osamu Shimomura (* 1928) public\u00f3 un art\u00edculo [3] en el que el componente fotog\u00e9nico era reconocido como una prote\u00edna. Trabajando con su profesor (Frank Johnson) en la Universidad de Princeton, recolectaron muestras de la medusa bioluminiscente Aequorea victoria. Ten\u00edan una forma \u00fanica de aislar las prote\u00ednas fluorescentes de las medusas, es decir, exprimir el tejido bioluminiscente aislado a trav\u00e9s de una bolsa de algod\u00f3n para producir una soluci\u00f3n que Shimomura llam\u00f3 \u00abexprimidores\u00bb.<\/p>\n<\/a><\/a><\/a>