{"id":1964,"date":"2017-09-15T12:44:45","date_gmt":"2017-09-15T17:44:45","guid":{"rendered":"http:\/\/www.bairesac.com\/blog\/?p=1964"},"modified":"2017-09-15T12:44:45","modified_gmt":"2017-09-15T17:44:45","slug":"fluorescencia-en-la-microscopia","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.bairesac.com\/blog\/archivo\/1964","title":{"rendered":"Fluorescencia en la microscopia"},"content":{"rendered":"

La microscop\u00eda de fluorescencia es una forma especial de microscop\u00eda \u00f3ptica. Utiliza la capacidad de los fluorocromos para emitir luz despu\u00e9s de ser excitado con luz de una determinada longitud de onda. Las prote\u00ednas de inter\u00e9s se pueden marcar con tales fluorocromos mediante tinci\u00f3n de anticuerpos o marcado con prote\u00ednas fluorescentes. Permite determinar la distribuci\u00f3n de una sola mol\u00e9cula, su cantidad y su localizaci\u00f3n dentro de una c\u00e9lula. Adem\u00e1s, se pueden llevar a cabo estudios de colocalizaci\u00f3n y de interacci\u00f3n, observ\u00e1ndose concentraciones i\u00f3nicas usando colorantes que se unen de forma reversible, p. Ca2 + y fura-2, y se observan procesos celulares como endocitosis y exocitosis. Hoy en d\u00eda incluso es posible imaginar part\u00edculas de sub-resoluci\u00f3n con la ayuda de la microscop\u00eda de fluorescencia.<\/p>\n

El cambio de Stokes<\/strong><\/p>\n

Un rasgo importante de la fluorescencia es el cambio de Stokes. Describe las diferencias en el nivel de energ\u00eda de un fot\u00f3n excitante y emitido. El fot\u00f3n emitido por un fluorocromo es de mayor longitud de onda que un fot\u00f3n excitante. Esto es debido a la liberaci\u00f3n de energ\u00eda a los alrededores despu\u00e9s de que el fluorocromo se excita, pero antes de que emita el fot\u00f3n. El cambio resultante en la longitud de onda hace posible distinguir entre la excitaci\u00f3n y la luz de la emisi\u00f3n. La absorci\u00f3n y emisi\u00f3n de energ\u00eda pueden ser vistas como caracter\u00edsticas espec\u00edficas de una especie de mol\u00e9cula.<\/p>\n

Un microscopio de fluorescencia<\/strong><\/p>\n

Un microscopio de fluorescencia (vertical o invertido) es similar a un microscopio de luz ordinario, excepto que la iluminaci\u00f3n es proporcionada por un l\u00e1ser como luz monocrom\u00e1tica o una fuente de luz brillante y potente como un vapor de mercurio o una l\u00e1mpara de arco de xen\u00f3n. Adem\u00e1s contiene un filtro de excitaci\u00f3n y un filtro de emisi\u00f3n. El filtro de excitaci\u00f3n transmite s\u00f3lo la luz que es capaz de excitar la muestra con su colorante particular. La luz emitida por la muestra tiene que pasar a trav\u00e9s del filtro de emisi\u00f3n antes de que llegue al detector. El filtro de emisi\u00f3n es s\u00f3lo transl\u00facido para la luz con una longitud de onda distinta, como la luz emitida por la muestra.<\/p>\n

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Fig. Camino de luz a trav\u00e9s de un microscopio de fluorescencia<\/figcaption><\/figure>\n

En los \u00faltimos a\u00f1os, los LED (diodos emisores de luz) tambi\u00e9n se han utilizado como fuente de luz para microscopios de fluorescencia. La longitud de onda de la luz emitida por los LED depende del material utilizado para la producci\u00f3n. Sin embargo, un filtro de excitaci\u00f3n es necesario en la mayor\u00eda de los casos, ya que los LED a menudo emiten luz en un amplio rango de longitudes de onda.<\/p>\n

La mayor\u00eda de los microscopios de fluorescencia son microscopios de epi-fluorescencia. El iluminador y la lente de objetivo est\u00e1n situados en el mismo lado de la muestra y la luz no pasa a trav\u00e9s de la muestra. Adem\u00e1s de la excitaci\u00f3n y el filtro de emisi\u00f3n, se necesita un espejo dicroico para este tipo de microscopio de fluorescencia. Un espejo dicroico permite que la luz de una determinada longitud de onda pase a trav\u00e9s, mientras que la luz de otras longitudes de onda se refleja. Los filtros y el espejo dicroico a menudo se conectan juntos en un cubo de filtro de una determinada longitud de onda pase a trav\u00e9s, mientras que la luz de otras longitudes de onda se refleja. Los filtros y el espejo dicroico a menudo se conectan juntos en un cubo de filtro.<\/p>\n

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Fig. 2: Principio de un cubo de filtro<\/figcaption><\/figure>\n

La luz de excitaci\u00f3n pasa a trav\u00e9s del filtro de excitaci\u00f3n y se dirige al espejo dicroico. Esto refleja la luz a trav\u00e9s del objetivo hacia el esp\u00e9cimen. Los fluorocromos de la muestra son excitados y emiten fotones. Esta luz de emisi\u00f3n pasa de nuevo a trav\u00e9s del objetivo al espejo dicroico. La luz emitida tiene una longitud de onda apropiada y es capaz de pasar. La luz de excitaci\u00f3n que es reflejada por la muestra no puede pasar a trav\u00e9s del espejo dicroico y ser\u00e1 bloqueada. Si la luz de excitaci\u00f3n es capaz de atravesar el espejo dicroico, se bloquear\u00e1 cuando alcance el filtro de emisi\u00f3n. La luz que pasa a trav\u00e9s del filtro de emisi\u00f3n se puede medir con un detector. Se utilizan diferentes tipos de filtros en microscop\u00eda de fluorescencia. Se pueden distinguir los filtros de paso de banda, paso largo y paso corto. Los filtros de paso de banda transmiten una banda de longitudes de onda, mientras que la luz con una longitud de onda mayor o menor ser\u00e1 bloqueada. Los filtros paso largo y paso corto son filtros de borde. Los filtros de paso largo transmiten luz de longitudes de onda largas. La luz con una longitud de onda por encima de cierto valor de corte no podr\u00e1 pasar. Por el contrario, los filtros de paso corto transmiten longitudes de onda cortas y bloquean los largos.<\/p>\n

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Fig. 3. Enbri\u00f3n de rat\u00f3n transg\u00e9nico. GFP<\/figcaption><\/figure>\n
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Fig. 4. Fluorescencia in situ – Hibridaci\u00f3n de cromosomas. Rojo: TRITC, azul: CY5, verde: FITC<\/figcaption><\/figure>\n

Diferentes t\u00e9cnicas en microscop\u00eda de fluorescencia<\/strong><\/p>\n

La microscop\u00eda de fluorescencia es ampliamente utilizada y ofrece gran especificidad. Diversas t\u00e9cnicas permiten abordar diferentes problemas e incluso eludir el l\u00edmite de difracci\u00f3n descrito por Ernst Abbe.<\/p>\n

La localizaci\u00f3n de una especie de mol\u00e9cula puede determinarse con una co-tinci\u00f3n de organelas, p. el citoesqueleto o las membranas. La microscopia confocal de barrido l\u00e1ser (CLSM) permite observar \u00e1reas en la muestra sin se\u00f1ales desde el exterior del plano focal y permite el corte \u00f3ptico. La microscopia de reflexi\u00f3n interna total (TIRF) es una t\u00e9cnica que permite observar una regi\u00f3n delgada cerca de la superficie celular. Un campo evanescente excita los fluorocromos en esta \u00e1rea.<\/p>\n

Una t\u00e9cnica para observar la din\u00e1mica de una especie de mol\u00e9cula es la recuperaci\u00f3n de fluorescencia despu\u00e9s del fotoblanqueo (FRAP). Los fluorocromos en una zona restringida son fotoblanqueados y se puede medir la difusi\u00f3n de mol\u00e9culas no blanqueadas en esta \u00e1rea. Los estudios de interacci\u00f3n pueden realizarse con microscop\u00eda de transferencia de energ\u00eda de fluorescencia (FRET). Un crom\u00f3foro donante excitado puede transferir energ\u00eda a un fluorocromo aceptor y excitarlo. Esto s\u00f3lo es posible si ambos se unen muy de cerca. Si estos tintes est\u00e1n acoplados a diferentes prote\u00ednas, s\u00f3lo podr\u00e1n transferir energ\u00eda y fluorescencia si las prote\u00ednas interact\u00faan entre s\u00ed.<\/p>\n

Las t\u00e9cnicas que permiten im\u00e1genes de sub-resoluci\u00f3n son la microscopia de agotamiento de la emisi\u00f3n (STED), la microscopia de agotamiento del estado fundamental (GSD), la microscop\u00eda de una sola mol\u00e9cula y el agotamiento del estado terrestre seguido por el retorno individual de mol\u00e9culas (GSDIM) y la microscop\u00eda de localizaci\u00f3n fotoactivada (PALM) microscop\u00eda de reconstrucci\u00f3n \u00f3ptica (STORM). Los microscopios de la sub-resoluci\u00f3n usados \u200b\u200bpara estas t\u00e9cnicas tambi\u00e9n se refieren como nanoscopes, pues resuelven im\u00e1genes en la escala del nan\u00f3metro.<\/p>\n

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Fig. 5. C\u00e9lula de Pukinje, secci\u00f3n parasagital triple etiquetada de la corteza cerebelosa de rat\u00f3n. Rojo: anti-calbindina-D28k \/ Cy3, verde: anti-GFAP \/ Cy5, azul: Hoechst 33258<\/figcaption><\/figure>\n
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Fig. 6. Secci\u00f3n de tejido de rat\u00f3n, autofluorescencia, Microscop\u00eda de vida de fluorescencia (FLIM)<\/figcaption><\/figure>\n

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La microscop\u00eda de fluorescencia es una forma especial de microscop\u00eda \u00f3ptica. Utiliza la capacidad de los fluorocromos para emitir luz despu\u00e9s de ser excitado con luz de una determinada longitud de onda. Las prote\u00ednas de inter\u00e9s se pueden marcar con tales fluorocromos mediante tinci\u00f3n de anticuerpos o marcado con prote\u00ednas fluorescentes. 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