{"id":1927,"date":"2017-08-14T09:37:45","date_gmt":"2017-08-14T14:37:45","guid":{"rendered":"http:\/\/www.bairesac.com\/blog\/?p=1927"},"modified":"2017-08-14T09:37:45","modified_gmt":"2017-08-14T14:37:45","slug":"efecto-agujero-en-microscopios-confocal","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.bairesac.com\/blog\/archivo\/1927","title":{"rendered":"Efecto agujero en Microscopios Confocal"},"content":{"rendered":"

Al operar un microscopio confocal, o al discutir caracter\u00edsticas y par\u00e1metros de un dispositivo de este tipo, se menciona ineludiblemente el agujero de alfiler y su di\u00e1metro. Este breve documento introductorio pretende explicar la importancia del agujero de alfiler para aquellos que no quer\u00edan dedicar demasiado tiempo a profundizar en la teor\u00eda y los detalles de la microscop\u00eda confocal, pero quer\u00edan tener una idea sobre el efecto del agujero de alfiler.<\/p>\n

Qu\u00e9 es un agujero de alfiler?<\/strong><\/p>\n

Los instrumentos \u00f3pticos basados \u200b\u200ben lentes se ocupan principalmente de dos par\u00e1metros: la curvatura de la lente y el di\u00e1metro. La curvatura define en qu\u00e9 direcciones los rayos paralelos son desviados, el di\u00e1metro define la cantidad de esos rayos que contribuyen a la imagen resultante. El di\u00e1metro podr\u00eda ser simplemente el marco de la lente, en muchos casos es un diafragma separado que delimita el di\u00e1metro de la viga. Los diafragmas comunes est\u00e1n hechos de l\u00e1minas mediante las cuales se controla el di\u00e1metro del diafragma. Sin embargo, los diafragmas muy peque\u00f1os no encajan con la tecnolog\u00eda actual de laminillas. La manera m\u00e1s simple de generar un diafragma muy peque\u00f1o es, pinchar un cart\u00f3n o una hoja de aluminio con una aguja (perno), por lo tanto, se llama un agujero de alfiler. Tales pinholes son el principio de trabajo de una \u00abcamera obscura\u00bb [1]<\/p>\n

\u00bfCu\u00e1l es el prop\u00f3sito del agujero en un microscopio confocal?<\/strong><\/p>\n

Los microscopios confocales permiten separar \u00f3pticamente las rebanadas de la respuesta de la muestra y grabarlas como im\u00e1genes. De manera \u00f3ptima, las rebanadas cubren s\u00f3lo la profundidad de foco generada en el microscopio.<\/p>\n

Para lograr esta tarea, la muestra es escaneada por un peque\u00f1o punto de luz. La forma m\u00e1s peque\u00f1a que se puede generar es un punto limitado de difracci\u00f3n. Un punto limitado de difracci\u00f3n en el plano focal del microscopio es la imagen de una fuente de luz en forma de punto y por lo tanto llamada \u00abfunci\u00f3n de propagaci\u00f3n de puntos, psf\u00bb. El psf es la distribuci\u00f3n de la luz en el foco de un dispositivo \u00f3ptico al imaginar un punto adimensional. Como todas las fuentes de luz convencionales no suelen tener forma de punto sino que tienen una extensi\u00f3n significativa, la fuente de luz se proyecta en una abertura diminuta, el agujero de alfiler, que act\u00faa como una fuente en forma de mancha.<\/p>\n

En el lado de detecci\u00f3n, el sensor debe seguir de igual manera. Es decir, la regi\u00f3n de detecci\u00f3n debe ser tambi\u00e9n un punto limitado de difracci\u00f3n, coincidente en todo momento con el punto de iluminaci\u00f3n. Esto se logra mediante una disposici\u00f3n similar: la luz de emisi\u00f3n es alimentada a trav\u00e9s de una abertura min\u00fascula, el agujero de alfiler de detecci\u00f3n, antes registrado por un elemento de detecci\u00f3n. Es este agujero de la detecci\u00f3n, que se refiere generalmente cuando mencionamos el \u00abagujero de alfiler\u00bb en un microscopio confocal.<\/p>\n

El t\u00e9rmino \u00abconfocal\u00bb se refiere a la exactitud de esta disposici\u00f3n: tanto la iluminaci\u00f3n y la detecci\u00f3n se centran en el mismo lugar [2]. Los focos coinciden. La imagen entonces se genera escaneando el campo de visi\u00f3n spotwise, como el haz de electrones en una tv-pantalla del siglo pasado. La exploraci\u00f3n se realiza usualmente mediante una disposici\u00f3n de espejos pivotables. Como se ilustra en la Figura 1 [3], el agujero de alfiler de detecci\u00f3n elimina todas las emisiones que no se originan desde el plano focal. Por lo tanto, tambi\u00e9n se conoce como \u00abfiltro espacial\u00bb, filtrando la profundidad de enfoque y bloqueando la se\u00f1al extrafocal. A medida que el dispositivo corta secciones de la muestra por medios \u00f3pticos, tambi\u00e9n se denomina \u00abcuchilla \u00f3ptica\u00bb.<\/p>\n

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Figura 1: El cuchillo \u00f3ptico. A) un microscopio compuesto genera una imagen intermedia (iim) por una lente objetiva (obj), que contiene se\u00f1al focal (roja) y extrafocal (rosa) emanada por la muestra (prp). Al visualizar un solo punto, el detector (det) registrar\u00e1 tanto una caracter\u00edstica en forma de punto desde el plano focal como los discos borrosos extendidos de otras regiones. B) introduciendo una abertura de agujero de alfiler (ph) en el plano de imagen intermedio, casi toda se\u00f1al extrafocal es cortada y solamente la emisi\u00f3n desde el plano focal puede alcanzar el detector. El filtro espacial genera una secci\u00f3n \u00f3ptica.<\/figcaption><\/figure>\n

\u00bfPor qu\u00e9 es variable el di\u00e1metro del agujero de alfiler? Para la imagen confocal general, la recomendaci\u00f3n es simplemente transmitir la parte interna de la caracter\u00edstica de difracci\u00f3n limitada por el agujero de alfiler. Esta parte interior se llama el \u00abdisco Airy\u00bb. El tama\u00f1o del disco Airy en la imagen intermedia depende de la longitud de onda (color), de la apertura num\u00e9rica NA, de la ampliaci\u00f3n de la lente objetivo y de la ampliaci\u00f3n de la \u00f3ptica interna del microscopio. La NA y la ampliaci\u00f3n del objetivo est\u00e1n grabadas en el cilindro de la lente. En consecuencia, el di\u00e1metro del agujero de alfiler requerido es diferente para diferentes colores y para diferentes lentes objetivas que tienen diferentes NA y \/ o aumento.<\/p>\n

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Figura 2: Di\u00e1metro del agujero de alfiler y patr\u00f3n de difracci\u00f3n. A la izquierda: c\u00edrculo rojo indica un agujero circular ajustado a 1 AU. Este agujero de alfiler cortar\u00e1 el disco interior del patr\u00f3n de difracci\u00f3n y generar\u00e1 una secci\u00f3n \u00f3ptica de la dimensi\u00f3n dz. AU = \u00abUnidad A\u00e9rea\u00bb. A la derecha: para la microscop\u00eda de re-exploraci\u00f3n de im\u00e1genes, se registra una serie de subconjuntos del patr\u00f3n de difracci\u00f3n. Estas im\u00e1genes se combinan y muestran una mayor resoluci\u00f3n lateral (en comparaci\u00f3n con el campo ancho). El rendimiento de corte \u00f3ptico seguir\u00e1 asumiendo el equivalente de la zona rescaneada, es decir, es equivalente a un agujero de alfiler ajustado a un tama\u00f1o indicado por el anillo rojo.<\/figcaption><\/figure>\n

Adem\u00e1s, un agujero de alfiler variable ofrece al usuario la libertad de aumentar la nitidez de la secci\u00f3n \u00f3ptica reduciendo el di\u00e1metro o reduciendo el rendimiento de corte \u00f3ptico aumentando el di\u00e1metro. \u00bfQu\u00e9 sucede, si el agujero de alfiler es m\u00e1s grande? Como se indic\u00f3 anteriormente, el agujero de alfiler para la imagen confocal general debe pasar el disco de Airy. El di\u00e1metro en este caso se conoce como \u00abAiry Unit, AU\u00bb. Este es un compromiso bueno y pr\u00e1ctico, no una ley por naturaleza. Cuando el agujero de alfiler se incrementa, m\u00e1s y m\u00e1s contribuciones extrafocales llegar\u00e1n al sensor y cada vez m\u00e1s niebla la informaci\u00f3n focal aguda [4]. La intensidad global est\u00e1 aumentando y aparentemente la relaci\u00f3n se\u00f1al \/ ruido (SNR) parece mejorar. Sin embargo, el aumento se debe a la recopilaci\u00f3n de se\u00f1ales borrosas no deseadas de capas fuera del plano focal. Si el agujero de alfiler es (virtualmente) infinito, el microscopio se comporta como un microscopio de campo ancho no confocal (ver Figura 3). Por lo tanto, por lo general, no se recomienda abrir el agujero de alfiler s\u00f3lo para el beneficio de reducir el ruido de la imagen.<\/p>\n

\"\"<\/a>
Figura 3: Respuesta axial al di\u00e1metro del agujero. Un entorno pr\u00e1ctico para la microscop\u00eda confocal es un di\u00e1metro de
1 AU (gris vertical). Al aumentar el di\u00e1metro, el detector captar\u00e1 se\u00f1al extrafocal, el rendimiento de la secci\u00f3n en z se deteriorar\u00e1, aunque la intensidad podr\u00eda aumentar. Para di\u00e1metros de agujeros inferiores a 1 UA, el rendimiento de corte seguir\u00e1 aumentando, pero asumen un valor limitado de difracci\u00f3n finita con un di\u00e1metro cero.<\/figcaption><\/figure>\n

La resoluci\u00f3n lateral no se ve afectada y se mantiene siempre en el valor que tambi\u00e9n es v\u00e1lido para la imagen de campo ancho y dado por la f\u00f3rmula de Abbe: d = \u03bb \/ 2NA (Ver Figura 4).\u00a0\u00bfQu\u00e9 sucede si el agujero de alfiler es m\u00e1s peque\u00f1o?\u00a0Las rebanadas \u00f3pticas m\u00e1s finas, en el l\u00edmite de difracci\u00f3n en direcci\u00f3n axial, se obtienen cuando el di\u00e1metro del orificio adopta cero. Esto, por supuesto, no es pr\u00e1ctico. De hecho, el grosor de la rebanada en el l\u00edmite de difracci\u00f3n es s\u00f3lo un 25% mejor [4] que en 1 UA.\u00a0Con excepci\u00f3n de los di\u00e1metros de agujeros por encima de 1 AU, tambi\u00e9n la resoluci\u00f3n lateral se ve afectada cuando el agujero de alfiler est\u00e1 cerrado. En el pinhole cero, se puede esperar un aumento en la resoluci\u00f3n lateral4 de ca. 30%. Esta mejora puede ser parcialmente explotada cerrando el agujero de alfiler un poco por debajo de la 1 UA recomendada. Por ejemplo a 0,6 UA, ya ganamos el 58% del incremento de resoluci\u00f3n posible. Para asegurar una buena relaci\u00f3n se\u00f1al \/ ruido, debemos utilizar un microscopio con muy buena eficiencia para la fluorescencia emitida y sensores pr\u00e1cticamente libres de ruido.<\/p>\n

\"\"<\/a>
Figura 4: Respuesta lateral al di\u00e1metro del agujero. La resoluci\u00f3n lateral a 1 UA es constante para aumentar los di\u00e1metros y corresponde a la resoluci\u00f3n de microscop\u00eda de campo ancho ordinario (resoluci\u00f3n limitada de difracci\u00f3n). Si el di\u00e1metro del agujero est\u00e1 por debajo de 1 AU, la resoluci\u00f3n lateral es mejorada. El aumento m\u00e1ximo en la resoluci\u00f3n es de aproximadamente el 30% en el di\u00e1metro cero del agujero. Ya en el di\u00e1metro del agujero de alfiler 0,6 AU aproximadamente el 60% del aumento de resoluci\u00f3n posible es explotado (vertical rojo)<\/figcaption><\/figure>\n

C\u00f3mo se relaciona esto con peque\u00f1as fracciones de psfs en escaneado de im\u00e1genes?\u00a0Una alternativa para cerrar el agujero de alfiler para aumentar la resoluci\u00f3n lateral es un m\u00e9todo, llamado \u00abrescanning de imagen\u00bb [5]. Aqu\u00ed, el patr\u00f3n de difracci\u00f3n en s\u00ed es escaneado de nuevo y las fracciones son redistribuidas a p\u00edxeles vecinos (vea la Figura 2, lado derecho). Mediante el c\u00e1lculo de una nueva imagen sint\u00e9tica, la resoluci\u00f3n lateral se puede aumentar aproximadamente un factor de 1,4 veces en comparaci\u00f3n con la microscop\u00eda de campo ancho, casi independiente del di\u00e1metro equivalente del agujero de alfiler. Sin embargo, el rendimiento de corte \u00f3ptico asumir\u00e1 el rendimiento de corte \u00f3ptico de toda la zona escaneada y seguir\u00e1 las relaciones mostradas en la Figura 3.<\/p>\n

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Al operar un microscopio confocal, o al discutir caracter\u00edsticas y par\u00e1metros de un dispositivo de este tipo, se menciona ineludiblemente el agujero de alfiler y su di\u00e1metro. 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