La fluorescencia es ampliamente utilizada en microscop\u00eda y una herramienta importante para observar la distribuci\u00f3n de mol\u00e9culas espec\u00edficas. La mayor\u00eda de las mol\u00e9culas en las c\u00e9lulas no fluorescen. Por lo tanto, tienen que ser marcados con mol\u00e9culas fluorescentes llamados fluorocromos. Las mol\u00e9culas de inter\u00e9s se pueden marcar directamente, (por ejemplo, ADN con DAPI) o pueden inmunomarcarse con fluorocromos que est\u00e1n acoplados a anticuerpos espec\u00edficos. La fijaci\u00f3n de las c\u00e9lulas suele ser necesaria para la inmunotinci\u00f3n.<\/p>\n
La microscop\u00eda de fluorescencia tambi\u00e9n permite im\u00e1genes de lapso de tiempo de c\u00e9lulas vivas o tejidos. Para este prop\u00f3sito las prote\u00ednas de inter\u00e9s pueden ser marcadas con mol\u00e9culas fluorescentes codificadas gen\u00e9ticamente como GFP (prote\u00edna fluorescente verde). Las mol\u00e9culas de inter\u00e9s (por ejemplo, Ca ^ {2+}) tambi\u00e9n se pueden marcar usando colorantes sint\u00e9ticos de uni\u00f3n reversible (por ejemplo, fura – 2) o prote\u00ednas de origen natural gen\u00e9ticamente modificadas (por ejemplo, derivados de GFP).<\/p>\n
Los cambios en los estados de energ\u00eda de los electrones conducen a la luminiscencia<\/strong><\/p>\n \u00a0La luminiscencia describe la ocurrencia de efectos luminosos que son causados \u200b\u200bpor el cambio de un electr\u00f3n de un estado excitado a un estado con energ\u00eda m\u00e1s baja. Los electrones pueden existir en diferentes estados de energ\u00eda. El estado fundamental es un estado muy estable para un electr\u00f3n y tiene el nivel de energ\u00eda m\u00e1s bajo. Si los electrones absorben energ\u00eda, pueden elevarse a un nivel de energ\u00eda superior, un estado excitado. Como el estado excitado es de mayor energ\u00eda que el estado fundamental, la energ\u00eda tiene que ser liberada cuando un electr\u00f3n vuelve a su estado fundamental. Esta energ\u00eda puede liberarse en forma de fotones emitidos.\u00a0Existen varias formas de luminiscencia que difieren en la forma en que el sistema se excita, p. En la electroluminiscencia el sistema se excita a trav\u00e9s de una corriente el\u00e9ctrica, la quimioluminiscencia se produce debido a una reacci\u00f3n qu\u00edmica y la fotoluminiscencia resulta de la excitaci\u00f3n a trav\u00e9s de fotones.\u00a0La fotoluminiscencia puede dividirse adem\u00e1s en dos subgrupos, fluorescencia y fosforescencia. La principal diferencia entre la fluorescencia y la fosforescencia es la duraci\u00f3n de su luminiscencia. La fluorescencia termina inmediatamente cuando se detiene la iluminaci\u00f3n. En contraste, la fosforescencia puede durar horas despu\u00e9s de que la excitaci\u00f3n haya terminado.<\/p>\n Fig.1: Cuando la luz de una determinada longitud de onda (longitud de onda de excitaci\u00f3n) golpea una mol\u00e9cula (por ejemplo, en un fluor\u00f3foro) los fotones son absorbidos por electrones de la mol\u00e9cula. Los electrones son entonces elevados de su estado fundamental (S0) a un nivel de energ\u00eda m\u00e1s alto, el estado excitado (S1 ‘). Este proceso se denomina excitaci\u00f3n (1). La vida \u00fatil del estado excitado es corta (t\u00edpicamente 10-9 \/ -10-8 segundos) y parte de la energ\u00eda del electr\u00f3n se pierde durante ese tiempo (2). Cuando los electrones abandonan el estado excitado (S1) y regresan al estado del suelo (3), pierden la energ\u00eda restante absorbida durante la excitaci\u00f3n. En el caso de los fluor\u00f3foros, la energ\u00eda se emite como luz (emisi\u00f3n de fluorescencia) de una longitud de onda m\u00e1s larga con (y por lo tanto con menos energ\u00eda) que la luz de excitaci\u00f3n. Este fen\u00f3meno se llama cambio de Stokes.<\/em><\/span><\/p>\n \n El mecanismo de fluorescencia\u00a0<\/strong><\/p>\n Los fluorocromos s\u00f3lo se fluorescen si se iluminan con luz de la longitud de onda correspondiente. La longitud de onda depende del espectro de absorci\u00f3n del fluor\u00f3foro y debe garantizarse que se suministre una cantidad apropiada de energ\u00eda para elevar los electrones al estado excitado. Despu\u00e9s de que los electrones son excitados pueden permanecer en este estado de alta energ\u00eda durante un tiempo muy corto solamente. Cuando los electrones se relajan a su estado fundamental u otro estado con un nivel de energ\u00eda m\u00e1s bajo, la energ\u00eda se libera como un fot\u00f3n. Como parte de la energ\u00eda se pierde durante este proceso, la luz con una mayor longitud de onda y menor energ\u00eda es emitida por el fluorocromo en comparaci\u00f3n con la luz absorbida.<\/p>\n <\/p>\n El mecanismo de fosforescencia<\/strong><\/p>\n Como las mol\u00e9culas fosforescentes pueden luminescerse durante mucho m\u00e1s tiempo que los fluorocromos, debe haber una diferencia en la forma en que almacenan la energ\u00eda de excitaci\u00f3n. La base de esta discrepancia se encuentra en las dos formas de niveles de excitaci\u00f3n, el estado excitado singlete y el estado excitado triplete, que se basan en diferentes alineaciones de esp\u00edn.<\/p>\n Las rotaciones son un atributo de los electrones. En t\u00e9rminos simplificados, el spin describe el momento angular del electr\u00f3n causado por su rotaci\u00f3n. La orientaci\u00f3n del spin de un electr\u00f3n puede ser positiva (+1\/2) o negativa (-1\/2). Los pares de spin de niveles de energ\u00eda m\u00e1s altos pueden ser paralelos o antiparalelos en su orientaci\u00f3n entre s\u00ed. En los pares de giros antiparalelos, los momentos angulares individuales se compensan entre s\u00ed y el giro total obtiene un valor de cero. Esta alineaci\u00f3n de spin se denomina estado singlete. Dos giros paralelos no compensan y obtienen un valor diferente de cero. En este caso se dice que los giros est\u00e1n en un estado triplete.<\/p>\n La fluorescencia ocurre cuando los electrones vuelven de un estado excitado singlete al estado fundamental. Pero en algunas mol\u00e9culas los giros de los electrones excitados pueden ser conmutados a un estado triplete en un proceso llamado cruzamiento entre sistemas. Estos electrones pierden energ\u00eda hasta que se encuentran en estado triplete. Este estado es de mayor energ\u00eda que el estado fundamental pero tambi\u00e9n de menor energ\u00eda que el estado excitado singlete. Por lo tanto, los electrones no pueden volver al estado singlete, ni pueden regresar f\u00e1cilmente al estado fundamental, ya que s\u00f3lo se permiten giros totales con un valor cero debido a la mec\u00e1nica cu\u00e1ntica. Por lo tanto, las mol\u00e9culas quedan atrapadas en su estado energ\u00e9tico.<\/p>\n Sin embargo, son posibles unos pocos cambios desde el estado base triplete hasta el estado fundamental a la vez. Estos cambios dan lugar a la emisi\u00f3n de fotones y la fosforescencia. Puesto que s\u00f3lo son posibles unos pocos eventos a la vez, el estado de tierra triplete presenta un tipo de dep\u00f3sito de energ\u00eda, haciendo posible la fosforescencia durante un per\u00edodo de tiempo m\u00e1s largo.<\/p>\n <\/p>\n <\/p>\n <\/p>\n <\/p>\n <\/p>\n <\/p>\n <\/p>\n <\/p>\n <\/p>\n <\/p>\n Luminescencia en microscop\u00eda\u00a0<\/strong><\/p>\n Para la microscop\u00eda, la fluorescencia es el tipo m\u00e1s \u00fatil de luminiscencia. Los fluorocromos pueden excitarse f\u00e1cilmente con su longitud de onda espec\u00edfica a trav\u00e9s de fuentes de luz espec\u00edficas (por ejemplo, l\u00e1mparas y sistemas de filtro o l\u00e1seres) y la luz emitida puede distinguirse de la luz de excitaci\u00f3n por la longitud de onda (cambio de Stokes).\u00a0Usando im\u00e1genes de fluorescencia, el experimentador puede caracterizar la cantidad y la localizaci\u00f3n de una mol\u00e9cula dentro de una c\u00e9lula. Otra ventaja de la microscop\u00eda de fluorescencia es que se pueden usar varios fluorocromos simult\u00e1neamente. Los fluorocromos s\u00f3lo tienen que variar en su longitud de onda de excitaci\u00f3n y emisi\u00f3n. Por lo tanto, se pueden observar simult\u00e1neamente diferentes mol\u00e9culas diana, permitiendo una gran variedad de experimentos, p. Estudios de colocalizaci\u00f3n, que deben realizarse.<\/p>\n <\/p>\n <\/p>\n <\/p>\n <\/p>\n <\/p>\n <\/p>\n <\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":" La fluorescencia es un efecto que fue descrito por George Gabriel Stokes en 1852. Observ\u00f3 que la fluorita empieza a brillar despu\u00e9s de ser iluminada con luz ultravioleta. La fluorescencia es una forma de fotoluminiscencia que describe la emisi\u00f3n de fotones por un material despu\u00e9s de ser iluminado con luz. 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